<국문초록>

MC3T3-E1 조골세포주에 있어서 TNF-a 유도성 증식억제 및 세포 자멸사에 대한 quercetin의 효과

골 생성은 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast)의 생물학적 조절에 기인되며, 어느 특정 세포만의 과다한 활성은 골다공증(osteoporosis) 및 골화석증(osteopetrosis) 등과 같은 골 대사성 질환을 야기시킨다.  quercetin은 조혈세포로부터 파골세포의 분화를 억제할 수 있으며, 각종 호르몬 및 염증성 cytokine의 생성을 조절함으로써 골 감소를 억제하고 나아가 대사성 골 질환을 효과적으로 제어할 수 있는 것으로 알려져 왔다.  그러나 quercetin이 조골세포의 증식, 분화 및 기능에 미치는 효과에 대한 기전은 아직까지 잘 알려지지 않고 있다.  따라서 본 연구에서는 대표적 염증 유발 cytokine인 종양괴사인자(tumor necrosis factor-alpha; TNF-a)와 생쥐 유래 조골세포인 MC3T3-E1 세포를 이용하여 quercetin이 조골세포의 증식과 세포고사, cytokine 생성 및 조골 기능 등에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구를 수행하고자 하였다.  아울러 다양한 시스템을 이용하여 quercetin의 항산화 특성에 대해서도 명확한 자료를 얻고자 하였다.  먼저 10 ng/ml의 TNF-a를 MC3T3-E1세포에 3일 동안 투여한 후 tritium 흡수량을 측정한 결과 DNA 합성이 대조군에 비해 약 12%정도 감소되었으며, quercetin을 첨가하였을 경우 DNA 합성은 더욱 현저하게 감소되었다. 또한 MTT 및 trypan blue 염색실험 결과 quercetin은 TNF-a 유도성 세포독성을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다.  그러나 MC3T3-E1 세포에 quercetin만을 처리했을 경우에는 어떠한 세포독성도 관찰되지 않았다.  TNF-a 및 quercetin 유도성 증식억제 및 세포독성이 어떠한 기작에 의해 일어나는 것인지 규명하기 위해 다양한 방법의 세포고사측정 실험을 수행하였다.  그 결과 TNF-a 처리 후 세포고사의 주요한 특징으로 알려진 DNA 절편화에 따른 TUNEL 염색세포수의 증가와 200 bp 크기의 핵 내 DNA ladder 증가 등이 관찰되었으며, 이러한 현상은 quercetin의 첨가 농도 의존적으로 더욱 현저하게 나타났다.  아울러  Annexin V/propidium iodide 이중염색 실험을 통해 TNF-a 유도성 세포독성 및 quercetin의 첨가에 따른 세포독성 촉진은 고사(apoptosis)에 의해 유도된다는 것을 보다 명확히 확인하였다.  덧붙여 Fura red 및 DiOC6를 이용한 flow cytometry 분석을 통해 MC3T3-E1 세포의 TNF-a 유도성 세포고사와 quercetin의 의한 고사촉진은 세포 내 미토콘드리아의 생물리화학적 변화와 민감하게 관여되어 있음을 확인하였다.  세포고사에 대한 세포 내 기전을 이해하기 위해 Western blot 분석을 실시한 결과 Fas 및 PARP 신호전달과정이 TNF-a 유도성 세포고사와 밀접하게 관계되어 있었다. quercetin 처리에 의한 TNF-a 유도성 세포고사의 촉진은 세포고사 유도인자인 Bid의 활성 촉진과 세포고사 억제인자인 Bcl-2 발현 억제를 통해 이루어지며, 이는 quercetin 첨가에 의한 미토콘드리아 내 cytochrome c의 방출과 PARP의 분열 촉진에 대한 근본적인 기전으로 나타났다.   한편 caspase에 대한 Western blot 분석결과 caspase 8 및 3도 TNF-a 유도성 세포고사 및 quercetin의 촉진효과에 관여하는 것으로 나타났으며, 반면 p53의 경우는 세포고사보다는 quercetin 단독처리시 나타난 p21에 의한 G0/G1 단계에서의 세포주기 정지와 관계되는 것으로 나타났다.  다른한편, 분화된 조골세포의 기능에 대한 quercetin의 효과를 보기 위해 화학적 유도방법을 통해 MC3T3-E1 세포를 분화시킨 다음 10 ng/ml의 TNF-a 및 다양한 농도의 quercetin(1-10 mM)을 처리한 다음 염증성 cytokine, 염기성 인산효소(alkaline phosphatase) 및  칼슘농도 등을 측정하였다.  그 결과 TNF-a는 분화된 MC3T3-E1 세포에 의한 IFN-g 및 IL-6의 생성을 촉진시켰으며, 이는 quercetin의 첨가에 의해 현저하게 억제되었다. 한편, TNF-a는 MC3T3-E1 세포 내 염기성 인산화효소의 활성 및 세포 내 칼슘의 축적을 현저하게 억제시키는 것으로 나타났으며, 미약하지만 quercetin은 그러한 TNF-a의 억제작용을 감소시키는 것으로 확인되었다.  최종적으로 quercetin의 항산화 특성을 명확히 규명하기 위해 DCFH-DA, deoxyribose, 및 NBT 등을 이용하여 실험을 수행하였다. 그 결과 quercetin은 prooxidant가 아닌 antioxidant로서 비타민 C와 같은 강력한 전자 공여체로서 활성을 가지는 것으로 나타났으며, glucose oxidase 유도성 hydroxyl radical, TNF-a 유도성 nitric oxide 및 xanthine oxidase 유도성 superoxide anion 등의 활성산소자유기에 대한 강력한 소거활성을 보여주었다.  지금까지의 결과를 종합해볼 때 TNF-a는 미분화된 MC3T3-E1 조골세포의 증식을 억제하고 세포고사를 유도시키며, quercetin은 TNF-a 유도성 세포독성 및 고사를 더욱 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.  그러나 quercetin은 분화된 MC3T3-E1 세포에 있어서 TNF-a 유도성 염증성 cytokine의 생성을 현저하게 억제시키며, TNF-a에 의한 조골기능 억제에 대해서도 보호효과를 가질 수 있는 것으로 나타났다.

Effects of quercetin on TNF-□-induced growth inhibition and apoptosis in MC3T3-E1 osteoblastic cells

Young-Mi Jeon

Department of Dentistry,

Graduate School, Chonnam National University,

Gwang-ju, 500-757, South Korea

(Directed by Professor Hyeon-Shik Hwang)

ABSTRACT

Imbalanced interaction between osteoblasts and osteoclasts can elicit a number of bone metabolic diseases, such as skewed activation of osteoclasts in osteoporosis and skewed activation of osteoblasts in osteopetrosis.  Bioflavonoid quercetin is thought to have an important role to inhibit bone loss by affecting osteoclastogenesis and regulating a number of systemic and local factors such as hormones and cytokines.  However, the precise effects of quercetin on the proliferation, differentiation, and function of osteoblasts remain to be further clarified.  The aims of this study were to examine how quercetin acts on tumor necrosis factor-alpha (TNF-a)-mediated growth inhibition and apoptosis in MC3T3-E1 osteoblastic cells and to investigate the effects of quercetin on cytokine production and mineralization of the cells.  In addition, the antioxidant property of quercetin was elucidated using various systems of radical generation.  Tritium uptake assay showed that TNF-a induced a slight inhibition of DNA synthesis in MC3T3-E1 cells.  In particular, quercetin treatment did not inhibit but accelerate the TNF-a-induced inhibition of DNA synthesis in a dose-dependent manner.  Both MTT and trypan blue staining assays also revealed that TNF-a reduced the cell viability of MC3T3-E1 cells such that the reduction was further facilitated by the addition of quercetin.  However, quercetin itself did not induce any cytotoxic effects on the cells.  In order to understand the nature of TNF-a- and/or quercetin-induced cytotoxicity, the apoptosis assays were carried out through TUNEL assay, PI staining of nuclei, agarose gel electrophoresis of genomic DNA, annexin V/PI double staining of cells, and measurement of calcium flux and MMP.  Initially, it was revealed that TNF-a induced apoptosis of MC3T3-E1 cells and this induction was further accelerated by the addition of quercetin in a dose-dependent manner, as evidenced by the increase of positively stained cells by TUNEL assay, the presence of many cells with low-level fluorescence of propidium iodide (PI), and the characteristic nuclear DNA ladder formation.  Annexin V/PI double staining confirmed that TNF-a-mediated cytotoxicity and its augmentation by quercetin was induced from apoptotic rather than necrotic cell death.  Furthermore, flow cytometric analyses using Fura red and DiOC6 supported the TNF-a-mediated apoptosis induction and its acceleration by quercetin in MC3T3-E1 cells.  Western blot analyses showed that the TNF-a-mediated apoptosis of MC3T3-E1 cells was associated with Fas and PARP pathways.  In particular, the activation of Bid and reduction of Bcl-2 protein with a corresponding augmentation of cytochrome c release and PARP cleavage were revealed to be closely related to the acceleration of TNF-a-induced apoptosis by quercetin in the cells.  Immunoblot data also indicated that caspase 8 and caspase 3, but not p53, were associated with TNF-a-mediated apoptosis and its promotion by quercetin in the MC3T3-E1 cells.  Alternatively, quercetin inhibited TNF-a-induced secretion of IFN-g and IL-6 in differentiated MC3T3-E1 cells, suggesting that quercetin plays a role as antiinflammatroy agent and inhibits cytokine-mediated bone resorption.  As indicated by the markers that are characteristics of the osteoblast phenotype, such as alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium deposition, TNF-a prominently inhibited the differentiation and mineralization of MC3R3-E1 cells.  In contrast, quercetin treatment inhibited the TNF-a-mediated reduction of ALP activity and calcium deposition, although the inhibitory effect was not dramatic.  In addition, quercetin itself did not affect the ALP activity and calcium deposition in MC3T3-E1 cells.  Finally, the different antioxidant experiments including DCFH-DA and deoxyribose assays showed that quercetin had as high a redox potential as the electron donor such as ascrobic acid.  However, NBT assay revealed that quercetin clearly scavenged reactive oxygen species as a powerful antioxidant.  Collectively, this study indicates that quercetin promotes TNF-a-mediated growth inhibition and apoptosis through a change in mitochondrial homeostasis of MC3T3-E1 cells, while it inhibites TNF-a-mediated secretion of inflammatory cytokines in differentiated MC3T3-E1 cells without any cytotoxic effects.  Taken together, the presnet study suggests that quercetin might have dual effects as stimulator of apoptotic cell death mediated by inflammatory cytokines in exponentially growing osteoblastic cells, and as inhibitor of inflammatory cytokine secretion in differentiated osteoblasts, which might block an osteoclastic activation from hematopoietic cells.